融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

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篇1：融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

目的:将限制性内切酶Fok Ⅰ催化区域基因(631bp)和PI-Sce Ⅰ识别区域的`基凼(546bp)连接到一起,克隆入载体质粒pET28a-~+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备.方法:分别以啤酒酵母和海床黄杆菌作模板,PCR扩增PI-Sce Ⅰ和FokⅠ基因片段,再将它们克隆人载体质粒pET28a~+,然后对整合质粒进行双酶切检测.结果:整合过程中,无论是PI-Sce Ⅰ还是Fok Ⅰ基因片段,都能单独成功插入载体,但当插入第二段基因片段时,酶切结果显示大约600bp的基因片段缺失了.结论:缺失可能因为两段连在一起的新基因在转化过程中对宿主细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切;也可能这两段基因会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接,产生缺失现象.

作 者：崔宝宁 王芳 王艳萍 张治洲  作者单位：泰达BIO-X系统生物技术研究中心,天津科技大学,天津300457 刊 名：生物技术  PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2010 20(2) 分类号：Q819 关键词：限制性内切酶   PI-Sce Fok Ⅰ   pET28a~+   克隆   双酶切   restriction endonuclease   PI - Sce Ⅰ   Fok Ⅰ   pET28a~+   clone   double digest  

篇2：pSITITIN载体的构建及表达

pSITITIN载体的构建及表达

目的构建能阻断Wistar大鼠肌联蛋白表达的siRNA载体,为研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化的过程中肌小节结构蛋白之间的相互关系打下基础.方法针对Wistar大鼠TITIN N2B区设计并构建重组质粒pSITITIN,针对人β-ACTIN设计并构建重组质粒pSIACTIN,利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养1周的新生大鼠心肌细胞和经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后2周的`MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白的表达.结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞和经5-aza处理后的MSCs后,肌联蛋白的表达均减弱(P＜0.01);而转染pSIACTIN后不影响肌联蛋白的表达.结论 pSITITIN具有确切阻断肌联蛋白表达的效果.

作 者：张小飞 陈沅 田杰 ZHANG Xiao-fei CHEN Yuan TIAN Jie  作者单位：重庆医科大学儿童医院心血管内科,重庆,400014 刊 名：第三军医大学学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 年，卷(期)：2006 28(7) 分类号：Q782 R394-33 R394.2 关键词：骨髓间充质干细胞   RNA干扰   肌联蛋白  

篇3：水稻碱性几丁质酶基因表达载体pCAMBIA1301-RC24的构建

水稻碱性几丁质酶基因表达载体pCAMBIA1301-RC24的构建

用限制性内切酶Kpn1从质粒pYAO24中切出大小约2.75 kb的片段,此片段包含Actinl启动子、NOS终止子、水稻几丁质酶基因.将其插入到表达载体pCAMBIA1301-imp的多克隆位点内,构建成了水稻碱性几丁质酶基因的表达载体.利用液氮冻融法将构建好的`表达载体导人发根农杆菌LBA4404中,以用于生物工程下游技术研究.

作 者：高丽美 李永锋 徐子勤 GAO Li-mei LI Yong-feng XU Zi-qin  作者单位：高丽美,李永锋,GAO Li-mei,LI Yong-feng(山西师范大学生命科学学院,山西,临汾,041004)

徐子勤,XU Zi-qin(西北大学生命科学学院生物技术省级重点实验室,陕西,西安,710069)

刊 名：山西师范大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF SHANXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 23(3) 分类号：Q782 关键词：质粒pYAO24   几丁质酶基因   表达载体pCAMBIA1301-imp   冻融法   发根农杆菌  

篇4：CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA (c)和gna基因相融合,得到CryIA (c)-2A-gna抗虫融合基因.并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA (c)-2A-gna)分别连接到植物表达载体pCAMBIA3300上,构建成由玉米UBI启动子驱动抗虫融合基因的植物表达载体pNUBG.经过限制性酶切分析鉴定,结果表明,含有融合基因的植物表达载体构建成功.

作 者：冯翠莲 张树珍  作者单位：冯翠莲(中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口571101;海南大学农学院,海南儋州,571737)

张树珍(中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101)

刊 名：热带作物学报  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS 年，卷(期)：2010 31(2) 分类号：Q78 关键词：重叠延伸PCR   FMDV2A   融合基因   表达载体   splicing by overlap extension PCR   FMDV2A   fusion gene   expression vector  

篇5：用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源.采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点.因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节.为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台--Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率.研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的.效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率.因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法.

作 者：杨建岭 顾淑萍 陈臣 王铸钢 许燕 费俭 YANG Jian-Ling GU Shu-Ping CHEN Chen WANG Zhu-Gang XU Yan FEI Jian  作者单位：杨建岭,许燕,YANG Jian-Ling,XU Yan(上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234)

顾淑萍,陈臣,王铸钢,费俭,GU Shu-Ping,CHEN Chen,WANG Zhu-Gang,FEI Jian(上海南方模式生物研究中心,上海,201203)

刊 名：生物工程学报  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(6) 分类号：Q782 关键词：Red/ET重组   基因打靶   载体  

篇6：几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因.实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的'chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB.通过表达载体pET-chiB的诱导表达.实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD.利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃.这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础.

作 者：叶辉 冯春 程郢 朱苏文 程备久 YE Hui FENG Chun CHENG Ying ZHU Su-wen CHENG Bei-jiu  作者单位：叶辉,YE Hui(安徽农业大学生物技术中心,安徽,合肥,230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽,合肥,230036)

冯春,FENG Chun(安徽农业大学农业园及试验总场管理中心,安徽,合肥,230036)

程郢,朱苏文,程备久,CHENG Ying,ZHU Su-wen,CHENG Bei-jiu(安徽农业大学生命科学学院,安徽,合肥,230036)

刊 名：激光生物学报  ISTIC英文刊名：ACTA LASER BIOLOGY SINICA 年，卷(期)：2008 17(3) 分类号：Q786 关键词：几丁质酶基因   pET-chiB   构建   表达   IPTG诱导   chitinase gene   pET-chiB   construction   expression   IPTG inducing  

篇7：基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建

基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建

目的:制备基于Xcm Ⅰ酶切的高效TA克隆载体,并检测其克隆PCR产物的效果.方法:设计一对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点,从而在该多克隆位点中引入2个Xcm Ⅰ酶切位点,用Xcm Ⅰ酶切后即获得含有3'突出T碱基的T载体;为了提高该T载体的克隆效率,优化了2个Xcm Ⅰ酶切位点之间的.碱基数目,排除了载体自连产生白色克隆的可能性,使假阳性大大减少;此外,为了便于完全酶切与未完全酶切载体的分离,在2个Xcm Ⅰ之间插入了一段无关DNA片段.结果:改进得到的T载体可以有效克隆PCR产物,其阳性克隆率可达95%.结论:构建了基于XcmⅠ酶切的TA克隆载体,经过改进的T载体具有很高的克隆效率.

作 者：顾Q 张昕 安小平陈锦辉 刘大斌 张宝中 周育森 童贻刚 GU Wei ZHANG Xin AN Xiao-Ping CHEN Jin-Hui LIU Da-Bin ZHANG Bao-Zhong ZHOU Yu-Sen TONG Yi-Gang  作者单位：顾Q,GU Wei(军事医学科学院,微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京,100071;济南军区联勤部,疾病预防控制中心,山东,济南,250014)

张昕,安小平,陈锦辉,刘大斌,张宝中,周育森,童贻刚,ZHANG Xin,AN Xiao-Ping,CHEN Jin-Hui,LIU Da-Bin,ZHANG Bao-Zhong,ZHOU Yu-Sen,TONG Yi-Gang(军事医学科学院,微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京,100071)

刊 名：生物技术通讯  ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2008 19(3) 分类号：Q78 关键词：T载体   限制性内切酶XcmⅠ   聚合酶链反应  

篇8：表达双功能融合蛋白(sCAR-EGF)腺病毒载体的构建及其活性检测

表达双功能融合蛋白(sCAR-EGF)腺病毒载体的构建及其活性检测

为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie virus-Adenovirus Receptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermal growth factor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315.利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF.经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片段,Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白.体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR的肿瘤的.靶向性基因治疗提供了新的手段.

作 者：任鹏康 王丰 李惠明 李宗海 黄倩 REN Peng-Kang WANG Feng LI Hui-Ming LI Zong-Hai HUANG Qian  作者单位：任鹏康,REN Peng-Kang(上海市第一人民医院中心实验室,上海,200080)

王丰,李惠明,黄倩,WANG Feng,LI Hui-Ming,HUANG Qian(上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080)

李宗海,LI Zong-Hai(上海交通大学肿瘤研究所癌基因及相关基因研究国家重点实验室,上海,200032)

刊 名：生物工程学报  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(5) 分类号：Q81 关键词：腺病毒   表皮生长因子受体   基因治疗   柯萨奇病毒-腺病毒受体  

篇9：结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv株的`基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.

作 者：程春明 曹以诚 杜正平杨化强 郭旭 方翔 张珍武 CHENG Chun-ming CAO Yi-cheng DU Zheng-ping YANG Hua-qiang GUO Xu FANG Xiang ZHANG Zhen-wu  作者单位：华南理工大学,生物科学与工程学院,广东,广州,510640 刊 名：河南工业大学学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HENAN UNIVERSITY OF TECHNOLOGY (NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 27(3) 分类号：Q781 关键词：结核   Ag85B   ESAT6   融合基因   核酸疫苗  

篇10：大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌.利用PCR方法分别从pGEM-5Zf(+)-STI、K88ab(LT+,ST+)质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框.LTB基因的5′位于STII基因的.3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽.将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105.

作 者：武冬梅 祝建波 陈创夫 王琦 张金波 WU Dong-mei ZHU Jian-bo CHEN Chuang-fu WANG Qi ZHANG Jin-bo  作者单位：武冬梅,WU Dong-mei(石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832003;新疆地方与民族高发病实验室,新疆石河子,832003)

祝建波,ZHU Jian-bo(新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子,832003)

陈创夫,CHEN Chuang-fu(新疆石河子大学动物科技学院,新疆石河子,832003)

王琦,张金波,WANG Qi,ZHANG Jin-bo(石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832003)

刊 名：西北农业学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA 年，卷(期)：2006 15(5) 分类号：Q786 关键词：产肠毒素大肠杆菌   ETEC   STI   STII   LTB   融合基因   植物表达载体  

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